| 分子生物基本技术(6) |
| 发布人：管理员 发布时间：2009年8月21日 |
第六章 基因组DNA的提取
第一节 概 述
基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。
本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。
第二节 从植物组织提取基因组DNA
一、材料
水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。
二、设备
移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。
三、试剂
1、提取缓冲液Ⅰ:100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。
2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。
3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
4、 RnaseA母液：配方见第一章。
5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
四、操作步骤：
（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取
1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。
2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。
3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
4. 室温下5000rpm离心5分钟。
5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。
9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。
13. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。
[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。
（二）. 从李(苹果)叶子提取基因组DNA
1. 取3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。
2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。
3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。
4. 同本节（一）中步骤3-13操作。
第三节 从动物组织提取基因组DNA
一、材料
哺乳动物新鲜组织。
二、设备
移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。
三、试剂
1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。
2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
四、操作步骤:
1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研 |
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