一、限制性内切酶酶切注意事项

    在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。根据各种不同的

条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：

1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活

性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。

2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。

3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应。

4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。

5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。

6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。

7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：

①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；

②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。

8. 用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与λDNA存在位点的数目比较后，决定用酶量。对于超螺旋DNA，基因组DNA、琼脂糖包埋的DNA，使用的酶单位活性应适当加大。

9. 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。

10.酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚，大于10mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。

11.DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的一个重要因素，